PROYECTOS INVESTIGACION Y DESARROLLO
INMUNOLOGÍA
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INMUNOLOGÍA:
Inmunoestimulantes en base a hemocianinas de moluscos litorales chilenos, con potencial aplicación en vacunas contra patógenos y cáncer.
Hemocianinas en biomedicina
Las vacunas son preparaciones farmacéuticas que protegen contra enfermedades producidas por patógenos y algunos cánceres, al generar inmunidad específica contra ellos. Su desarrollo es, sin lugar a dudas, uno de los mayores logros de las ciencias biomédicas y de la salud pública humana y veterinaria. Están compuestas por un antígeno (sustancia que confiere la inmunidad específica) y por una sustancia denominada adyuvante, la cual co-administrada con el antígeno, mejora significativamente su eficacia. Los adyuvantes son inmunoestimulantes, dan la señal de alarma al sistema inmune del ingreso de un antígeno al cuerpo y, además, determinan el curso de la respuesta. Así, existen adyuvantes que potencian la secreción de anticuerpos específicos contra el antígeno por los linfocitos B; y hay otros que potencian el ataque de linfocitos T específicos contra células infectadas con virus y células tumorales.
Los inmunoestimulantes también pueden ser administrados por sí solos, teniendo múltiples beneficios para la salud, ya que pueden actuar como agentes profilácticos para elevar las barreras de defensa del organismo, otorgándole una mayor resistencia en condiciones de estrés, frente a patógenos o frente a células tumorales. Su naturaleza química es muy variada, abarcando desde bacterias completas y componentes de la pared bacteriana a glucanos de hongos, nucleótidos sintéticos, citoquinas, ligandos de receptores de inmunidad innata y también, algunas proteínas, como es el caso de las hemocianinas.
Fig. 2. Especímenes de Concholepas Concholepas, comúnmente conocido como Loco, Se muestra un ejemplar con el pie hacia abajo protegido por su concha (izquierda) y otro ejemplar de lado, donde se observa el pie central y el manto adosado a la cara interior de la concha (derecha).
Las hemocianinas son glicoproteínas enormes (Fig.1), que circulan libremente en la hemolinfa de algunos moluscos, cuya función más conocida es transportar oxígeno, coordinándolo con átomos de cobre presentes en su estructura. Su notable inmunogenicidad cuando son inoculadas en los mamíferos, atribuida generalmente a su carácter xenogénico (lejanía filogenética entre los moluscos y los mamíferos), su enorme tamaño y su compleja estructura cuaternaria, les ha permitido ser usadas en variadas aplicaciones en biomedicina y biotecnología.
Actualmente se utiliza hemocianina como proteína transportadora (carrier) para producir anticuerpos contra sustancias que no son inmunogénicas (denominadas haptenos) como péptidos y carbohidratos y, además, como carrier/adyuvante en algunas vacunas contra patógenos y cáncer. También, por si solas, se utilizan como inmunoestimulante no específico en la terapia del cáncer superficial de vejiga, una vez que el tumor se ha extirpado, sin efectos secundarios nefastos. Por más de 40 años para estas aplicaciones se utilizó exclusivamente la hemocianina proveniente de la lapa californiana keyhole limpet (de la especie Megathura crenulata), conocida como KLH. Hasta antes de los trabajos de nuestro laboratorio, se desconocía si otras hemocianinas tenían similar o mejor capacidad inmunoestimulante en los mamíferos.
Nuestro grupo de investigación demostró por primera vez que la hemocianina del molusco chileno Concholepas Concholepas (Fig. 2), denominada CCH, tiene características inmunoestimulantes comparables a KLH (Moltedo et al. J. Urol, 2006). También descubrimos que la hemociani
FIG. 3 Especímenes de Fissurella latimarginata, comúnmente conocida como Lapa negra, Se muestra un ejemplar con el pie hacia arriba y el manto adosado a la concha (izquierda) y otro ejemplar de lado donde se aprecia su amplio y negro pie debajo de la concha (derecha).
na proveniente de la Lapa negra (de la especie Fissurella latimarginata) (Fig. 3), la cual denominamos FLH, tiene propiedades inmunogénicas y antitumorales superiores a la CCH y KLH (Arancinbia et al. PlosOne, 2014),
Fig. 1. Moléculas de hemocianina al microscopio electrónico con tinción negativa, Se muestran moléculas vistas desde arriba (círculos) y de lado (rectángulos). Barra 100 nm.
confiriéndole así un enorme valor agregado e insospechadas aplicaciones biomédicas a proteínas que eran desechadas durante la faena de extracción de estos moluscos. A la fecha, CCH ha sido usada como carrier de diversos haptenos y como adyuvante en una vacuna terapéutica basada en células dendríticas, en un estudio de Fase Clínica I en pacientes con cáncer de próstata, con buenos resultados (Reyes et al. Br J Cancer, 2013).
Aun cuando KLH, CCH y FLH tienen una apariencia semejante, el análisis experimental de su estructura muestra diferencias. KLH y CCH poseen dos tipos de subunidades (Oliva et al. Hybrid Hybridomics, 2002) y se organizan de diferente forma a nivel de la estructura cuaternaria (Fig 4) (De Ioannes et al. J Biol Chem, 2004). En el caso de FLH, posee una sola subunidad (Arancibia et al. PlosOne. 2014).
Fig. 4. Las subunidades que forman las hemocianinas de moluscos adoptan diferentes organizaciones. Panel superior: Las dos isoformas de KLH (KLH1 y KLH2), se asocian de forma independiente para generar dos homodecámeros (formados por 10 subunidades), los cuales se asocian formando homodidecámeros. Panel intermedio: FLH sólo presenta una subunidad, que da origen a homodecámeros y homodidecámeros. Panel inferior: Las dos subunidades de CCH (CCHA y CCB) se asocian entremezcladas en una proporción 1:1 para dar origen a heterodecámeros y heterodidecámeros. (Tomado de J. Pizarro, Tesis Magíster en Bioquímica, Universidad de Chile, 2016)
FIG. 5: Hemocianias inducen respuestas inmunes de tipo Th1. Las hemocianinas inoculadas en el cuerpo, son fagocitadas por células dendríticas quienes las presentan a linfocitos T CD4+, quienes inducen a linfocitos Th1 a secretar IFN- e IL-2, entre otras, las cuales activan a los macrófagos y son responsables de la inmunidad celular mediada por células.
Sobre los mecanismos de acción de las hemocianinas en el sistema inmune de los mamíferos
Si bien las hemocianinas han sido ampliamente utilizadas en biomedicina,los mecanismos inmunológicos por los cuales activan el sistema inmune son pobremente conocidos. Esto llevó a nuestro grupo de investigación a estudiar no solo la inmunogenicidad y efecto antitumoral de CCH y FLH, sino que también, la relación entre sus rasgos estructurales y sus capacidades inmunoestimulantes. La idea-fuerza que ha conducido estos estudios ha sido demostrar cómo las hemocianinas, por sí solas, potencian la respuesta del sistema inmune, buscando en su estructura el/los rasgo o componente/s que lo activa. ¿Pero, cuál es/son ese/esos componente/s, su forma, su tamaño, su xenogenicidad o la presencia de azúcares en ellas?
Determinamos que CCH al igual que KLH es capaz de inducir una respuesta inmune del tipo Th1, del inglés lymphocyte T helper 1 (Moltedo et al. J. Urol. 2006) (Fig. 5), caracterizada por la producción de anticuerpos de tipo IgG específicos y la secreción de Interferon-g, citoquina que estimula una respuesta celular de macrófagos, linfocitos y células Natural Killer, ya sea contra células infectadas por patógenos o células tumorales.
Fig. 6. Macropinocitosis de CCH por macrófagos murinos cultivados in vitro. Imagen tomada al microscopio electrónico de un macrófago que está incorporando moléculas de hemocianina a su interior (flechas).
Interesantemente, descubrimos que ni la forma, ni el tamaño son determinantes sobre las propiedades inmunológicas de las hemocianinas, porque las subunidades aisladas de CCH también son inmunogénicas y tienen efecto antitumoral (Becker et al. Int Immunopharmacol. 2009). Más aún, estudiando las células que dirigen la respuesta inmune adaptativa, conocidas como células presentadoras de antígenos (APCs), que incluyen a macrófagos y células dendríticas, observamos que las hemocianinas son incorporadas por ambos tipos celulares mediante macropinocitocis (Fig. 6) y por vesículas recu
biertas de clatrina (Fig 7), lo que nos indicó que podrían haber receptores de la inmunidad innata que distinguen en estas proteínas algo particular, donde podrían estar involucrados sus azúcares, muy ricos en monosacáridos como manos
a, pero que también incluyen fucosa, N-acetilglucosamina y galactosa (Arancibia et al. Eur J Immunol, 2012; 2014).
Fig.7. Endocitosis de CCH mediada por clatrina en células dendríticas murinas cultivadas in vitro. Imagen tomada al microscopio electrónico de una célula dendrítica que está incorporando moléculas de hemocianina (flechas negras) en zonas de la membrana plasmática que contienen canastillos de clatrina (flechas rojas)),
Sumado a lo anterior, descubrimos que las hemocianinas permanecen largo tiempo en las APCs en comparación con otras proteínas xenogénicas, lo cual es una propiedad que afecta favorablemente la calidad de una respuesta inmune. Determinamos también que, en los macrófagos, las hemocianinas inducen la expresión de genes que codifican para citoquinas proinflamatorias del tipo M1, las cuales conducen una respuesta adaptativa del tipo Th1, manteniendo reprimidos genes que inducen la respuesta hacia una de tipo M2 (Zhong et al. J Immunol, 2016).
Por otra parte, un hallazgo reciente muestra que en humanos y en algunos animales de interés productivo, existen anticuerpos naturales que reaccionan en forma cruzada con KLH, CCH y FLH, y que estos activan la vía clásica del complemento in vitro, resultados que no solo mostrarían otra manera mediante la cual las hemocianinas actúan sobre el sistema inmune, sino que también abren posibilidades para diseñar nuevas herramientas de diagnóstico e inmunoterapia basadas en estas proteínas (Pizarro-Bauerle, et al. Front Immunol, 2017).
Actualmente, los principales estudios que llevamos adelante en el tema están enfocados en:
- Evaluar el papel de los azúcares en el efecto inmunoestimulante de las hemocianinas, especialmente a nivel de su efecto antitumoral.
- Estudiar la interacción de las hemocianinas con receptores de la inmunidad innata, de la familia de receptores lectina tipo C.
- Establecer la vía de transducción de señales inducidas por las hemocianinas y que conducen a la generación de un ambiente pro-inflamatorio.
- Desarrollar nuevas formulaciones farmacéuticas en base a CCH y FLH que potencien su efecto antitumoral para tratar cánceres más agresivos, como el melanoma y el cáncer oral.
MICROBIOLOGÍA
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MICROBIOLOGIA:
Péptidos con actividad antimicrobiana aislados desde moluscos litorales chilenos, con potencial de aplicación en bacterias de interés en salud pública humana y veterinaria
Los animales invertebrados poseen eficientes mecanismos inmunes del tipo innato que involucran tanto células fagocíticas como factores humorales, entre los que se incluyen los péptidos antimicrobianos (AMPs, del inglés antimicrobial peptides).
Los AMPs se definen como moléculas anfifílicas, generalmente catiónicas y que contienen un rango variable de entre 10 y 100 aminoácidos y con una masa molecular que, en la mayoría de los casos, no sobrepasa los 10 kDa. Su efectividad se basa en su especificidad para interactuar con la membrana de las bacterias, donde producen poros que provocan su lisis, o bien la traspasan e inhiben su metabolismo. Otra de sus ventajas es que, una vez aislados y secuenciados, su pequeño tamaño permite sintetizarlos químicamente o clonarlos y expresarlos heterólogamente, con el fin de ser usados en diversas aplicaciones farmacéuticas y biotecnológicas.
Se han identificado numerosos AMPs, que presentan actividad contra un amplio espectro de microorganismos y que tienen baja o nula toxicidad en células de vertebrados, característica que ha impulsado las investigaciones tendientes a su utilización como antibióticos, aprovechando la ventaja que presentan un amplio espectro de acción antimicrobiana y que la gran mayoría de ellos no inducen el fenómeno que en salud pública se conoce como “resistencia a antibióticos”. Es así que actualmente, numerosos AMPs se encuentran en evaluación en estudios de Fase Clínica para demostrar su efectividad en distintas formulaciones farmacéuticas, como colirios, cremas para heridas crónicas y soluciones de uso parenteral. También, se están evaluando en bacterias que afectan especies animales y vegetales productivas, así como en el campo de los alimentos, al agregarse como aditivos o coadyuvantes para su mejor preservación.
En este contexto y considerando los extensos recursos marinos chilenos, los cuales han sido escasamente explorados en la búsqueda de AMPs, el estudio que se lleva adelante en esta línea de investigación se centra en la búsqueda, caracterización y aplicación biotecnológica de péptidos con actividad antimicrobiana presentes en la hemolinfa o en hemocitos de algunos moluscos chilenos, que tengan un potencial en el control de bacterias que afectan la acuicultura nacional.
Encontramos que extractos de hemocitos de C. concholepas exhiben una actividad antimicrobiana de amplio espectro tanto en bacterias Gram negativas (V. parahaemolyticus y E. coli) como Gram positivas (S. aureus y L. monocitogenes). A través de un análisis mediante microscopia electrónica, caracterizamos los hemocitos y encontramos al menos dos tipos celulares que presentan gránulos electrón-densos en su citoplasma, que de acuerdo a lo descrito en la literatura almacenan AMPs (Manubens et al. Cell Tissue Res, 2010).
La caracterización de la actividad antibacteriana de los extractos de hemocitos mediante diversos métodos electroforéticos, ha permitido identificar péptidos a los cuales se les ha determinado su secuencia y perfil de actividad con diferentes bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Actualmente, estamos enfocados en establecer las aplicaciones de los péptidos antimicrobianos encontrados en el extracto de hemocitos de Concholepas.
Fig. 8. Actividad antimicrobiana de extractos de hemocitos de C. concholepas frente a E. coli y aislamiento de fracciones por HPLC. Superior: cada cuadrante corresponde a una muestra independiente. 1) Agua. 2) Mezcla de antibióticos. Alcohol. 5, 6, 7, 8 y 13) Halos de inhibición del crecimiento bacteriano. El resto de las fracciones en los cuadrantes 4, 9 a 12 y de 14 en adelante, no presentaron actividad. Inferior: Cromatograma de un extracto de hemocitos de C. concholepas leído a 220 nm. En rojo se muestra la absorbancia, en azul el gradiente de ACN que va de 0% a 100% en 30 minutos y en enmarcada la zona que presenta actividad antimicrobiana.